表观遗传系列干货1丨DNA甲基化

表观遗传学是指“研究基因的一级核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达发生可遗传的变化的一门学科”，由英国科学家Conrad H. Waddington于1942年首次提出[1]，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和RNA甲基化等，在接下来的“表观遗传学”主题干货系列中将逐一为大家详细阐述。今天先一起来了解DNA甲基化吧！

DNA的甲基化修饰

DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变DNA片段的活性、从而改变遗传表现，是一种非常保守的表观遗传修饰。DNA甲基化可以发生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位、鸟嘌呤的N-7位等，它们分别由不同的DNA甲基化酶催化，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）、N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鸟嘌呤（7-mG）。一般研究中所涉及的DNA甲基化主要是指发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点）中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，其产物称为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。5-mC是一种重要的表观遗传修饰，在哺乳动物胚胎发育中至关重要，同时与多种疾病相关，异常的甲基化模式可能导致基因沉默或过表达，进而引发疾病，如癌症等。

图1、DNA甲基化的类型

DNA甲基化修饰过程由DNA甲基转移酶（DNMT）催化，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基基团（-CH₃）转移到特定区域的特定碱基上。哺乳动物中主要有DNMT3A、DNMT3B和DNMT1三种甲基转移酶，根据催化的甲基化模式可分为从头甲基化和维持性甲基化。DNMT3A和DNMT3B属于从头合成甲基转移酶，主要负责从头甲基化，从头甲基化指在原本未甲基化的DNA序列上全新建立甲基化标记的过程，其主要出现在胚胎干细胞的发育中，识别DNA上非甲基化的胞嘧啶，建立新的甲基化模式。DNMT1属于维持性甲基转移酶，主要负责维持甲基化，维持性甲基化是在DNA复制后，将亲代DNA链的甲基化模式精确复制到子代链上的过程，其主要作为DNA复制复合物中的重要组成部份，在识别记忆性甲基化位点后，通过亲核攻击，催化子链DNA半甲基化位点甲基化，以维持从头合成甲基转移酶已建立的甲基化模式[2]。

图2、DNA甲基化的两种模式[3]

DNA的去甲基化修饰

DNA去甲基化是指DNA上的甲基化修饰被移除的过程，可以通过被动或主动机制实现。被动去甲基化发生在DNA复制过程中，当DNMT1活性受到抑制时，新合成的DNA链无法被甲基化，甲基化标记未能被复制链继承而逐渐稀释。主动去甲基化则不依赖于DNA复制，而是通过一系列酶促反应直接移除甲基化修饰，包括TET（ten-eleven translocation）家族蛋白将5mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），并进一步氧化为5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），最终通过碱基切除修复（BER）途径去除甲基化标记。

图3、TET介导的DNA去甲基化通路[4]

DNA甲基化的生物学作用

DNA甲基化现象始终伴随着每个哺乳动物的生命进程，它在调控基因表达、维持基因组稳定、印迹清除和重建等生物学过程起到了至关重要的作用。

（1）DNA甲基化与基因表达调控

在真核生物基因组中，基因仅仅占一小部分，例如在人类基因组中基因的编码序列还不到2％，那么在大量非编码DNA存在的情况下，实现精确控制基因的表达，降低周围的转录噪音对生物体至关重要。DNA甲基化为基因的表达调控提供了一种有效的机制，它就像基因的“开关”，决定哪些基因该开启，哪些该关闭。基因启动子区内CpG位点的甲基化可通过3种方式影响该基因表达调控[5]：①DNA序列甲基化直接阻碍转录因子的结合，因存在于DNA双螺旋分子大沟中的甲基基团会阻止特定基因与转录因子的结合作用从而干扰基因表达，导致转录水平上基因沉默；②甲基CpG结合蛋白（methyl-CpG-bindingproteins MBPs）结合到甲基化CpG位点与其他转录复合抑制因子相互作用或招募组蛋白修饰酶改变染色质结构从而阻碍基因转录；③染色质结构的凝集阻碍转录因子与其调控序列的结合从而阻碍基因转录。

图4、DNA甲基化抑制基因转录的机制[5]

（2）DNA甲基化与维持基因组稳定

转座子（Transposons）也称为“跳跃基因”，是一类可以在基因组中移动的DNA序列。如果转座子不受控制地移动，可能会插入重要的基因或调控区域，导致基因功能破坏或基因组不稳定。DNA甲基化可以沉默转座子的活性，防止它们在基因组中“跳跃”。通过甲基化转座子区域的CpG位点，细胞可以抑制转座子的转录和移动，从而维持基因组的稳定性。

图5、转座子被DNMT1、DNMT3A/B维持的CG甲基化沉默[6]

（3）DNA甲基化与基因印记

基因组印记是性细胞系的一种表观遗传修饰，这种修饰有一整套分布于染色体不同部位的印记中心来协调。印记中心直接介导了印记标记的建立及其在发育全过程中的维持和传递，并导致以亲本来源特异性方式优先表达两个亲本等位基因中的一个，而使另一个沉默。基因组印记是可遗传的，DNA的甲基化在基因组印记的分子机理中充当重要角色。在目前发现的印迹基因中，几乎所有的印迹基因其某一亲代的等位基因中都有一段甲基化序列，称特异性甲基化区域（differentially methylated region，DMR）[7]。以人的发育为例，若基因印迹作用丧失，本应处于“关闭”状态的基因被错误激活开启会严重阻碍胎儿的生长与个体发育，导致疾病的发生，如贝-威综合症（Beckwith-Wiedemann syndrome，BWS）。

图6、Igf2/H19基因座的DMR印记控制[7]

DNA甲基化与疾病

在生物体中适当的DNA甲基化对于正常的细胞功能和机体发育至关重要。但是当甲基化过程出现异常可能导致各种疾病的发生，其中包括癌症、神经退行性疾病、自身免疫疾病等。

（1）DNA甲基化与肿瘤发生

DNA甲基化在肿瘤发生中具有双重作用。一方面，全局性的低甲基化（hypomethylation）可能导致基因组不稳定，激活原本被沉默的转座子和原癌基因。例如，2014年发表在《Gut》的研究论文“Hypomethylation of long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) leads to activation of proto-oncogenes in human colorectal cancer metastasis”通过对比正常结肠黏膜、原发性结直肠癌组织（PC）和肝转移组织（LM）样本的长穿插核元件-1（LINE-1）甲基化，发现原发性和转移样本中LINE-1有着比正常样本更低的甲基化水平，同时LINE-1激活了多个原癌基因[8]。另一方面，局部的高甲基化（hypermethylation）则可能导致肿瘤抑制基因的沉默。例如，在非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）中被证实某些肿瘤抑制基因（如RASSF1A、CDKN2A）因启动子区域高甲基化而沉默，促进了肿瘤的发生和发展[9]。

图7、LINE-1重复元件的甲基化状态与癌症（CRC）的致癌作用以及肝转移相关[9]

（2）DNA甲基化与神经退行性疾病

DNA甲基化异常与许多神经退行性病变有关。阿尔茨海默病（AD）是老年人第一常见的神经退行性疾病，AD的主要病因学假说是淀粉样变途径，多种因素可以通过调控与Aβ相关基因的DNA甲基化水平，通过这种途径来干扰Aβ的沉积或者清除，进而影响其发病。淀粉样前体蛋白（APP）、β-分泌酶1（BACE1）、早老素1（PSEN1）是Aβ产生过程中的重要参与者，脑啡肽酶（NEP）能催化裂解沉积的Aβ，分拣蛋白相关受体1（SORL1）能促进APP的循环和清除，抑制其在体内的表达。多项研究表明，AD患者大脑皮质或外周血中APP、BACE1、PSEN1、NEP、SORL1启动子甲基化水平都有显著的变化，APP、BACE1、PSEN1基因启动子区域DNA甲基化水平降低，APP外显子及SORL1启动子甲基化水平升高[10]。

图8、淀粉样蛋白生成途径各检查点的DNA甲基化改变[10]

（3）DNA甲基化与自身免疫疾病

自身免疫性疾病是一种多因素复杂的疾病，常见自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、多发性硬化病和I型糖尿病等。近年来全基因组甲基化图谱分析发现T淋巴细胞的低甲基化和自身免疫性疾病密切相关。以系统性红斑狼疮疮(systemic lupus erythematosus，SLE)为例，有文献报道SLE的易感性和多基因位点相关，并且发现T淋巴细胞DNA甲基化异常在SLE发病机理中发挥重要作用[11-13]。T淋巴细胞DNA甲基化抑制剂，如普鲁卡因胺和肼苯哒嗪在动物模型中能够引起狼疮样疾病。对其发病机理研究发现主要是MAPK和ERK通路受到抑制，降低了Dnmt1的活性，导致T淋巴细胞DNA的低甲基化[14]。而T淋巴细胞的低甲基化能够影响其染色质的结构从而使淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)，如白细胞抗原CD11a、白细胞抗原CD18、白细胞抗原CD70的过表达，导致T淋巴细胞的自身免疫反应[12-13]。

图9、SLE中T淋巴细胞DNA异常甲基化(“↓”代表活性下降)[15]

（4）DNA甲基化与原发性高血压

原发性高血压（essential hypertension，EH）是以动脉血压升高为特点的一种复杂的多因素疾病，然而目前其发病机制尚未明确，但有大量证据表明原发性高血压是以遗传和环境为主要因素的多因素相互作用所导致的一种复杂性疾病，而无论是遗传因素还是环境因素都会不同程度地影响表观遗传修饰，DNA甲基化作为为一种常见的表观遗传修饰，近年来，通过基因DNA甲基化研究高血压疾病的发病机制受到越来越多人的关注。有很多研究显示神经内分泌系统、免疫系统相关基因的DNA甲基化改变，参与了原发性高血压的发生发展[16,17]。已发现血管紧张素Ⅱ受体(an giotensinⅡ receptor，ATR)基因、11β-羟基类固醇脱氢酶-2( 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2，11β HSD-2)基因、内皮素转换酶1( endothelin converting enzyme-1，ECE-1)和，血管紧张素转换酶ACE( Angiotensin converting enzyme，ACE)基因等基因发生甲基化和去甲基化会影响代谢酶和受体的表达，从而通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活以及肾性水钠潴留等途径引起高血压的发生，这些基因通过甲基化调控参与了高血压病的发生和发展[18]。

表1 特定基因DNA甲基化与原发性高血压的相关性研究结果[18]

（5）DNA甲基化与Ⅱ型糖尿病

Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是由胰岛素抵抗及胰岛素相对分泌不足，引起蛋白质、脂肪、电解质及代谢产物紊乱的一类慢性疾病。T2DM的发生发展与遗传及环境因素密切相关，而以DNA甲基化为代表的表观遗传调控容易受到环境因素的影响，在DNA序列不改变的情况下实现了表型的变化。因此，DNA甲基化成为联系T2DM发病机制与其环境因素、遗传因素的重要纽带。随着全基因组测序技术的深入研究，已发现了60余个Ⅱ型糖尿病的易感基因，也有研究者对胰岛细胞内DNA甲基化模式进行全基因组研究，Rönn等在其2015年的研究中对比Ⅱ型糖尿病患者和正常对照组总共1649个CpG位点，共853个基因，这些基因中已知的和Ⅱ型糖尿病有关的基因位点包括TCF7L2、KCNQ1、THADA、FTO、IＲS1及PPARG等，发现Ⅱ型糖尿病患者和对照组相比其中102个基因的DNA甲基化水平发生改变[19]，说明Ⅱ型糖尿病的易感基因的表观遗传修饰的改变是致病的潜在机制之一。

图10、Ⅱ型糖尿病靶组织中的DNA甲基化异常[19]

DNA甲基化的检测

DNA甲基化在真核生物中提供了一个关键的表观遗传调控层，在许多疾病发展过程中具有重要意义。DNA中胞嘧啶碱基甲基化的功能最初被认为是“沉默”表观遗传学标记，几十年来一直专注于基因的启动子区域。随着技术升级和研究积累，对DNA甲基化作用的理解扩展到各种基因组环境，包括基因体、重复序列和转录起始位点。而对全面描述DNA甲基化模式的需求催生了多种针对其基因组分布的DNA甲基化分析技术，这些方法能够在基因组水平上从限制区域特定位点单碱基分辨率检测DNA甲基化。

包括：

（1）亚硫酸氢盐测序：利用亚硫酸氢盐处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，该方法被认为是“金标准”，适用于精确测定特定区域的甲基化状态。该技术准确性高，能够提供单个碱基的甲基化信息；但操作繁琐，不适合高通量分析。

（2）质谱法：可直接检测DNA分子中的甲基化情况。适用于精确测定特定DNA片段的甲基化水平。该技术不依赖DNA序列，能够提供定量的甲基化数据；但仪器昂贵，操作技术要求高。

（3）甲基化特异性PCR：设计特异性引物针对甲基化或未甲基化的序列进行PCR扩增，常用于快速筛查特定基因的甲基化状态。该技术操作简便，成本相对较低；但只能提供有限的CpG位点信息，可能受到非特异性扩增的影响。

（4）芯片技术：利用特异性探针捕获甲基化DNA片段，然后进行芯片杂交分析，适用于同时分析多个基因或整个基因组的甲基化状态。该技术能够实现多样本和多位点的并行分析；但探针覆盖范围和分辨率受限于芯片设计。

（5）高通量测序技术：结合亚硫酸氢盐处理对全基因组或特定区域进行甲基化分析，用于全基因组甲基化图谱的构建和大规模甲基化研究。该技术能够提供全基因组范围内的高精度甲基化数据，但成本较高，数据分析复杂。

图11、DNA甲基化分析方法的演变[20]

DNA甲基化的应用

DNA甲基化在疾病发生发展、环境因素暴露与响应、发育和分化、疾病标志物研究中有着广泛的应用。临床上主要应用于肿瘤的诊断。

（1）早期诊断：DNA甲基化被认为是肿瘤发生的早期事件，通过检测血液、尿液等无创样本中的DNA甲基化水平，可以用于肿瘤的早期筛查。例如，结直肠癌、胃癌、肺癌等多种类型的癌症都已经有了成熟的DNA甲基化检测项目。

（2）辅助诊断：DNA甲基化异常常见于肿瘤中，通过检测特定基因的甲基化状态，可以提供肿瘤的辅助诊断信息。例如，结直肠癌中SEPT9基因的甲基化状态可以用于早期诊断；胃癌中RNF180和SEPT9基因的甲基化检测可以提高筛查的灵敏度。

（3）疗效监测和复发监测：DNA甲基化状态可以反映肿瘤的治疗效果及复发情况。通过定期监测治疗后肿瘤相关基因的甲基化变化，可以评估治疗的有效性并及时发现复发。

（4）预后评估：DNA甲基化还可以用于肿瘤的预后评估。某些基因的甲基化水平与肿瘤患者的生存率和预后密切相关，有助于医生制定后续的治疗和护理计划。

这些方面展示了DNA甲基化在肿瘤诊疗过程中的重要价值，尤其是在早期筛查、诊断和治疗监测方面。随着技术的发展，DNA甲基化有望成为肿瘤精准医疗中的一个重要组成部分。1066vip威尼斯生物专营病毒包装十余载，建立了庞大的基因研究现货工具库，现可提供DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因过表达相关产品，dCas9-DNMT3A等甲基化调控基因的表达工具，如有技术或产品需求，欢迎随时咨询1066vip威尼斯生物微信公众号或拨打官网技术服务热线：400-092-0065

本期内容主要介绍了表观遗传学中的DNA甲基化，从概念、机制、生物学作用、检测方法和应用五个方面进行了详细介绍。希望对DNA甲基化研究方向的小伙伴可以有所裨益。下期我们将继续为大家介绍表观遗传学中的组蛋白甲基化，敬请关注！

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