骨肉瘤（OS）是一种高度恶性的骨肿瘤，主要发生于儿童和青少年群体。其具有高复发倾向和早期转移特性，尤其易转移至肺实质。目前的标准治疗包括广泛手术切除和化疗，而放疗仅建议用于无法切除的肿瘤。然而，骨肉瘤常对传统化疗药物产生耐药性，导致肿瘤复发，且患者预后在过去三十年中未见明显改善。此外，近几十年来多项针对强化治疗的临床试验均未能显著提高治愈率。因此，亟需开发新型治疗策略以克服化疗耐药性，改善OS患者的生存率。

2025年2月24日，海军医科大学长征医院肖建如教授团队在Bone Research（IF：14.3）杂志发表了题为《Targeting AKT as a promising strategy for SOX2-positive, chemoresistant osteosarcoma》的研究论文，为OS耐药研究带来了新突破。已有研究表明SOX2的高表达是OS发生的一个主要驱动因素，该研究中作者通过激酶抑制剂文库筛选发现AKT是维持OS细胞中SOX2高表达所必须的激酶，且在OS中AKT的表达与SOX2呈正相关。机制解析发现AKT可以使SOX2的T116位点磷酸化，阻断E3泛素连接酶UBR5和STUB1所介导的SOX2的降解，促进SOX2蛋白的稳定性。进一步研究发现AKT-SOX2轴是调节肿瘤干性和化疗耐药的关键因素，且在PDX模型中利用AKT抑制剂MK2206与顺铂联合用药对肿瘤有显著的协同治疗效果。总之，该研究明确了AKT在促进OS中SOX2高表达、肿瘤干性以及化疗耐药性方面的关键作用，并为治疗难治性OS提供了潜在的疗法策略。

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1.SOX2在OS中显著上调并与患者预后密切相关

已有报道SOX2在多种癌症中高表达，作者通过对来自上海长征医院骨肿瘤科OS患者的标本进行WB和IHC检测显示，SOX2在肿瘤组织内的表达高于癌旁组织。且肿瘤组织中SOX2的平均免疫组织化学评分也显著高于癌旁组织，并在肿瘤组织中具有更高的高表达率（图1a-d）。生存分析发现SOX2高表达的患者总生存率更低（图1e）。这些结果表明SOX2与OS不良预后相关，是OS中潜在的关键癌蛋白。

图1. SOX2在OS组织中表达上调，且与不良预后相关

2.SOX2促进OS细胞的体外增殖、迁移和干性

为了确定SOX2在OS中的功能，作者对OS细胞系进行了SOX2基因敲低，细胞功能实验发现SOX2基因敲低后显著降低了OS细胞的活力、增殖及迁移能力（图2a-g），成球实验发现SOX2敲低也显著降低了OS细胞系的成球能力（图2h）。以上实验表明，SOX2可以维持OS细胞的增殖、迁移及干细胞样特性。

图2. 体外实验中，SOX2可促进OS细胞的增殖、迁移以及成球能力

3.AKT是OS细胞中维持SOX2高表达所需的激酶

靶向SOX2被认为是一种潜在的治疗策略，但由于SOX2作为转录因子的不可药物性，很难直接靶向SOX2。已有报道在多种癌症中，激酶的磷酸化作用可稳定SOX2，但在OS中SOX2的异常高表达是否与磷酸化有关仍不清楚。作者利用80种细胞激酶的抑制剂文库进行筛选发现AKT抑制剂可以显著下调SOX2的表达（图3a），且不同浓度AKT抑制剂MK2206以剂量依赖的方式下调SOX2蛋白水平（图3b）。此外，作者也通过敲低AKT发现其可以下调SOX2的蛋白水平但不改变mRNA水平（图3c）。添加蛋白酶体抑制剂MG132可以阻断AKT敲低导致的SOX2蛋白表达的抑制，表明抑制AKT可通过蛋白酶体降解途径下调SOX2蛋白（图3d）。且蛋白稳定性实验表明，敲低AKT可使SOX2蛋白的半衰期从大约9h缩短至不到6h（图3e）。为了评估SOX2和AKT在OS中的相关性，WB检测7种OS细胞系发现SOX2蛋白水平与AKT或AKT pS473的蛋白水平正相关，对上海长征医院骨科肿瘤数据库中12例OS病人蛋白组学测序数据分析也显示SOX2与AKT的蛋白水平呈正相关（图3f-g）。这些数据共同表明，在OS中，SOX2的表达与AKT正相关。

图3. AKT是OS中SOX2稳定性的潜在正向调节因子

4.在OS中AKT磷酸化SOX2，保护其免受E3连接酶介导的泛素化和降解

已有研究报道在人食管癌中，AKT可磷酸化SOX2 T116使其免受UBR5介导的泛素降解（图4a）。为了确定OS中AKT是否通过SOX2 T116位点的磷酸化调控其稳定性，作者通过过表达SOX2 野生型WT及T116A和T116D突变体，结合MK2206处理，WB检测确定AKT稳定SOX2是通过磷酸化其T116位点实现（图4b）。接着，作者敲低了E3泛素连接酶UBR5和STUB1，检测发现敲低UBR5和STUB1可阻断MK2206诱导的SOX2降解（图4c-d）。且过表达UBR5和STUB1可显著下调SOX2蛋白水平（图4e-f），并将SOX2蛋白半衰期从12h缩短至3h（图4g-h）。进一步作者研究SOX2与UBR5和STUB1之间的互作是否受SOX2 T116磷酸化的影响，发现MK2206处理后SOX2与UBR5和STUB1的互作增强（图4i-j）。上述结果表明，在OS细胞中，AKT通过阻断SOX2与UBR5和STUB1之间的互作使SOX2免于被降解。

图4. AKT通过对SOX2磷酸化来抑制E3泛素连接酶介导的泛素化降解，从而促进SOX2的稳定性

5.AKT-SOX2轴在OS的肿瘤干性和化疗敏感性方面起着重要作用

鉴于肿瘤干细胞可能对化疗更具抗性，且SOX2在多种癌症中均可促进肿瘤干细胞的功能，因此作者进一步研究其在OS的化疗敏感性和肿瘤干性中的作用。OS病人组织IHC实验证明SOX2和p-AKT在化疗耐药病人组织中高表达，化疗耐药组织中SOX2的IHC评分也更高，且p-AKT和SOX2的表达正相关（图5a-c）。FACS富集ALDH+的肿瘤干细胞及体外成球实验发现其在化疗耐药组织中更多（图5d-e），且SOX2和p-AKT在化疗耐药组织中上调（图5f）。AKT敲低可以抑制肿瘤细胞成球能力，但过表达SOX2可以逆转此作用（图5g）。

图5. AKT-SOX2轴在化疗耐药的OS中具有正向调控作用

为了探究SOX2在化疗耐药中的作用，作用检测了SOX2敲低和过表达细胞株对于顺铂（DDP）处理的敏感性，发现SOX2敲低细胞对顺铂敏感性增加，而SOX2过表达则使对于顺铂的敏感性降低。同样的，AKT敲低细胞株对于顺铂的敏感性也增加（图6a-h）。接着作者利用MK2206处理的样品进行GSEA分析表明MK2206抑制了OS细胞中的干性相关通路（图6i-k）。以上均表明AKT-SOX2轴在OS的肿瘤干性及化疗敏感性中的作用。

图6. AKT-SOX2不足增强了OS细胞对顺铂的敏感性

6.MK2206在OS治疗中与顺铂发挥协同作用

此前结果已证明AKT-SOX2轴在OS干性中的关键作用，因此，作者选用MK2206作为OS的候选药物。联合用药实验表明，MK2206与顺铂联合使用具有良好的协同作用，且抑制了OS细胞的增殖及克隆形成能力，促进了细胞凋亡（图7a-e）。PDX（人源肿瘤异种移植模型）小鼠模型也证明联合用药比单独用药具有更显著的肿瘤抑制效果，且WB检测进一步证明，联合用药后p-AKT和SOX2的蛋白表达水平均下降（图7f-i）。

图7. MK2206可以克服化疗耐药性，并与顺铂发挥协同作用

综上所述，该研究确定了AKT是导致OS中SOX2异常高表达的关键致癌激酶，阐明了AKT-SOX2轴在OS的肿瘤干性和化疗耐药中的关键作用，并开发了AKT抑制剂MK2206与顺铂联合用药的治疗策略，提高了OS对化疗药物的敏感性，为OS的治疗提供了潜在方案。

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