基因载体选择及不同调控方式载体的选择

不同载体选择

在进行基因表达调控时，无论是体外细胞或者在体感染动物组织或脏器，我们都要选择合适的载体来进行目的序列的递送。目前主流工具载体主要有非病毒载体（人工合成核酸和质粒）和病毒载体（慢病毒、腺病毒、腺相关病毒）。

非病毒载体

非病毒载体中人工合成核酸和质粒载体，都是瞬时调控基因表达的载体。这两种载体都需要借助一定的方法转导进入细胞，常用的转染方法是脂质体转染的方法：通过脂质体与核酸形成阳离子复合体，然后被吸附到带负电的细胞膜表面，然后通过内吞作用进入细胞进而发挥作用。除脂质体转染的方法外，也有磷酸钙沉淀法、电转染法和显微注射的方法，可以根据目的细胞的特性选择合适的方法。

病毒载体

随着病毒生物学的发展，种类繁多的病毒载体已越来越成为向各种实验系统（如细胞系、原代细胞、组织脏器等）转运核酸的重要工具。除了在实验室的组织培养和动物模型生产中发挥重要作用，它们还被用于治疗遗传性疾病的临床试验中。目前主流的病毒载体系统主要包括慢病毒（LV）、腺病毒（Ad）和腺相关病毒（AAV）。

慢病毒（Lentivirus，LV）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因表达载体，是单链RNA病毒，可以高效感染分裂和不分裂的细胞。其典型特征为其RNA基因组能逆转录为cDNA副本，cDNA副本又能稳定整合至宿主细胞基因组中（这就是常说的稳转），如果有稳转建系的需求，慢病毒无疑是一个最好的选择。

重组腺病毒（Adenovirus，Ad）是人为改造的一种复制缺陷的病毒载体系统，是双链DNA病毒，目前常用的是基于人腺病毒5型（Ad5型）的病毒载体，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织。另外，针对悬浮细胞的感染，1066vip威尼斯生物也独家研发了悬浮细胞专用腺病毒（Ads）可供选择。腺病毒是瞬时基因表达调控载体。

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）为无包膜的单链线状 DNA 病毒。只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以AAV被称作腺相关病毒。腺相关病毒滴度高，可达1x10^12-13，且安全性高、免疫原性小、表达周期久，是在体基因表达调控的利器。目前AAV有12 种血清型、100多种变体，不同的血清型对组织或器官有着不同的亲和性，1066vip威尼斯生物根据文献对不同组织或脏器适合的血清型做了归纳整理（图1），可供大家参考选择。

图1.不同AAV血清型对组织和脏器的亲和性

不同调控方式的载体选择

基因的表达调控方式就是针对我们的靶标基因（编码基因和非编码基因）进行敲低、过表达、敲除和基因原位敲入等，那么不同的调控方式往往需要选择合适的载体来进行，下面我们对不同调控方式的载体选择做具体介绍。

干扰载体

基因干扰依据的是细胞内RNA干扰的原理，指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源 mRNA 高效特异性降解的现象。那么对于干扰我们可以人工合成dsRNA（也就是siRNA）利用脂质体转染细胞进行基因下调表达，这种方法很方便，但 siRNA是瞬时转染，瞬时调控，且对于不好转染的细胞就不太适合了，这时候就要考虑病毒载体。那么病毒载体做干扰用的是shRNA，利用病毒载体来介导shRNA的表达达到干扰的目的，并且慢病毒可以达到稳定转染的目的。图 2 是1066vip威尼斯生物的一个用于基因干扰的慢病毒质粒载体，shRNA 序列需要 U6 启动子（或者H1启动子）来启动表达，U6属于聚合酶III型（polIII）启动子，主要用来启动比较短的 RNA，如shRNA、CRISPR 系统的gRNA 等 500nt以下的小RNA，而且末端需要4-6个连续的T来终止转录（一般用6个T）。

讲到这里有一个要注意的就是无论siRNA还是shRNA，它们介导的干扰都发生在细胞质，但并不是所有RNA都定位于胞质，如lncRNA、circRNA等非编码RNA可能会定位于细胞核内，RNA干扰相关复合体根本接触不到，更不要说干扰了。那这时候就需要借助一种称为 ASO 的特殊修饰过的翻译核苷酸（phosphorothioate-modified antisense oligodeoxy nucleotides），其可以成功进入核内，来达到敲低的目的。

图2.慢病毒干扰载体质粒

过表达载体

过表达主要是利用载体上的强启动子元件（CMV,EF1 等）来启动目的基因编码序列或非编码基因序列转录，实现目的基因的上调表达。图3是1066vip威尼斯生物用于过表达的一个慢病毒载体质粒的示意图。那么其实质粒或者病毒都可以作为过表达的载体工具。对于编码基因，只需将其编码区插入载体启动子后进行表达即可；对于LncRNA将其全长序列放在启动子后进行过表达；对于circRNA，因为需要成环表达，所以需要在其全长序列两端加上成环元件；对于microRNA，我们可以直接人工合成模拟物（mimics/agomir）利用脂质体转染的方法来表达，或者利用质粒、病毒载体来表达其前体或者成熟体即可。

图3.慢病毒过表达载体质粒

基因敲除/敲入载体

目前基因敲除/敲入最常用的就是CRISPR/cas9系统了。CRISPR/Cas系统起源于细菌的一套防御系统，细菌通过一段crRNA引导cas蛋白特异性的切割整合到其基因组上的噬菌体基因，从而抵御噬菌体的入侵。CRISPR/Cas 系统存在于不同的微生物中，也有多种不同的类型。其中最早被改造用于哺乳动物细胞基因编辑的是基于2型CRISPR/Cas系统的CRISPR/Cas9，也是目前应用最为广泛的一套系统。

如果仅仅是基因敲除，那我们只需要表达gRNA和cas9的载体即可，通过gRNA 引导 cas9 对靶基因切割造成双链断裂，然后利用细胞内的非同源末端连接的DNA修复通路进行修复。由于非同源末端连接通路本身是错误倾向的，在修复过程中往往会产生一些突变，以及短的插入或缺失，从而造成基因的移码突变等从而使基因失去功能。那如果要做基因的原位点突变或者片段敲除，亦或者引入蛋白标签（比如 3FLAG）、荧光、抗性筛选标记等，这些情况就要做敲入。敲入是在表达gRNA和cas9的同时，引入一个同源修复模板donor，之后细胞就可能会利用同源重组修复通路来对被切断的基因片段进行同源重组修复，从而达到敲入的目的。

关于CRISPR/cas9 系统的表达载体，除了常规的质粒载体外，1066vip威尼斯生物也有慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的质粒载体以及cas9病毒现货可供选择。