【qPCR系列】1-qPCR原理与qPCR常见荧光标记物

qPCR的定义和原理：

传统PCR技术能够对特定DNA片段进行指数扩增，其扩增产物可通过凝胶电泳进行定性分析，或借助放射性核素标记结合光密度扫描实现定量分析。然而，上述方法均局限于对PCR终产物的检测，无法反映扩增起始时的模板数量。为满足对起始模板精确定量的需求，实时荧光定量PCR技术应运而生。

实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）是对传统PCR技术的革新。该技术将荧光标记与PCR扩增过程相结合，利用专用仪器对累积荧光信号进行实时追踪。由于每个循环的荧光信号强度与该时刻的DNA扩增产物量成正比，通过分析达到设定荧光阈值所需的循环数（Ct值），即可依据定量关系模型，准确计算出起始模板的浓度。

原理：

通过重复变性-退火-延伸循环（通常25 ～40次），目标DNA呈指数级扩增：

①变性：高温（94～98℃）使双链DNA解离为单链

②退火：降温至50～65℃，荧光探针/染料特异性结合目标DNA序列。

③延伸：耐高温DNA聚合酶（如Taq酶）在72 ℃催化核苷酸延伸，合成新链。

通过荧光标记实时追踪扩增产物量：

① 染料法：如SYBR Green，非特异性结合双链DNA，荧光强度与产物量成正比。

② 探针法：如TaqMan探针，含报告基团和淬灭基团，扩增时探针水解，荧光释放。

常见荧光标记物：

SYBR Green I （性价比之王）

SYBR Green I是一种广泛使用的qPCR荧光染料，其工作原理是与所有双链DNA（dsDNA）的双螺旋小沟区域结合。该染料在游离状态下荧光微弱，一旦与dsDNA结合，荧光强度便会显著提升，且增强的荧光信号与体系中的dsDNA总量成正比，从而实现定量检测。

• 原理：嵌入DNA双链发荧光

• 优点：便宜、通用性强

• 缺点：易非特异性结合

• 适用：快速筛查/初实验

TaqMan探针（精准狙击手）

TaqMan探针是一种5'端带荧光报告基团（R）、3'端带淬灭基团（Q）的双标记探针。其定量原理基于FRET效应：在完整状态下，Q基团会淬灭R基团的荧光；当探针与靶序列杂交后，Taq酶的5'→3'外切酶活性会在PCR延伸过程中将其水解，使R与Q分离，随之释放荧光。该荧光信号与扩增产物量成正比，借此可实现实时定量。

• 原理：探针水解后释放荧光

• 优点：特异性超高

• 缺点：设计复杂、成本高

• 适用：临床诊断/多基因并行检测

分子信标（智能开关型）

分子信标（molecular beacon）是一种茎环结构的双标记寡核苷酸探针。其两端的荧光基团与淬灭基团在自然状态下因结构折叠而相互靠近，导致荧光被淬灭。当探针与靶模板结合时，其构象由茎环结构转变为线性杂交状态，致使两基团分离，继而释放出荧光信号。

• 原理：茎环结构靶标结合后发光

• 优点：信噪比优异

• 缺点：合成难度大

• 适用：突变检测/病原体分型