IF=26.8|工程化树突状细胞精准靶向病灶，缓解肠道炎症，为肠病患者带来新希望

本研究设计了一种基于树突状细胞（DC）的免疫调节剂（FasL-DC-Lipo），通过调节IBD病灶免疫微环境缓解肠道炎症反应，在腹腔注射后定向迁移至肠道组织，调节关键细胞因子的水平，并在动物模型中实现对 IBD 的持续缓解。。此外，这种免疫调节剂可以使用人类外周血单核细胞（PBMCs）和骨髓源性树突状细胞（BMDCs）进行制备，且都具备强大的诱导T细胞凋亡的能力，表明其在临床转化方面具有巨大的潜力。该研究提出了一种有效的缓解肠道炎症的治疗方案，为IBD的治疗提供了新思路。

下面，我们一起来了解具体的研究内容：

1.Fas在IBD病变组织中高表达，并且可能成为针对T细胞的治疗靶点

IBD的发生发展与肠道内的一系列分子变化有关，作者首先对溃疡性结肠炎（UC，IBD的一种）患者的肠道组织进行了蛋白质组学分析，来探究IBD病变与健康肠道之间的蛋白表达差异。结果显示，与T细胞募集（如CCL21）和激活（如MALT1、HLA-C、HLA-E、SEC21A、IKBKG）相关的蛋白在IBD组中的表达显著高于健康组，而与T细胞凋亡相关的蛋白（galectin2、galectin3、AIFM1）则表达下降（图1b-f）。

基于上述检测结果，作者认为IBD病变中的肠道T细胞能够在疾病病程中持续激活并耐受清除，因此，抑制T细胞过度激活可能成为治疗IBD的一种潜在方法。于是作者分析了与细胞凋亡相关的差异蛋白，来寻找调节激活T细胞的潜在靶点，发现与健康组相比，IBD组中caspase4、MLKL和Fas的表达显著上调（图1g），其中Fas定位于细胞膜上。此外，IBD组的T细胞浸润增加（图1h）。免疫荧光结果显示，Fas和CD3在IBD患者的肠道中共定位，表明IBD组的淋巴细胞中Fas高表达（图1i）。

先前有研究报道活化的T细胞会上调Fas的表达，并对FasL诱导的细胞凋亡变得敏感，有助于维持免疫平衡。结合上述发现，作者认为Fas或许能够通过诱导肠道淋巴细胞的凋亡来抑制T细胞过度激活，可作为IBD的潜在治疗靶点。

图1. UC患者结肠的蛋白质组学研究及Fas表达水平分析

2. FasL-DC-Lipo在体外可诱导CD8

T细胞和中性粒细胞发生凋亡

作者假设过表达FasL的BMDCs可能会主动靶向IBD病灶，并启动Fas/FasL信号传导触发淋巴细胞凋亡。为验证这一想法，作者构建了过表达FasL的BMDCs和DC2.4稳转株（FasL hi DCs）。鉴于中性粒细胞浸润也会促进IBD的进展，作者对FasL hi DCs进行了RvE-1负载的脂质体改造。RvE-1能够抑制中性粒细胞迁移，并通过激活中性粒细胞和巨噬细胞中的ChemR23蛋白来调节巨噬细胞凋亡。

FasL hi DC-脂质体复合物（FasL-DC-Lipo）能够将FasL和RvE-1定向递送至IBD病灶，并诱导T细胞和中性粒细胞凋亡（图2a）。蛋白质印迹法和流式细胞术结果表明FasL hi DCs中FasL上调（图2b-c），同时在生物复合体膜上检测到了来自脂质体（DiR标记的）和FasL的信号（图2d）。此外，约98.3%的BMDCs被脂质体修饰，约75.2%为FasL hi 细胞（图2e）。观察到BMDCs和FasL-DC-Lipo具有相似的球形形态（图2f）。此外，FasL-DC-Lipo能够实现高药物装载量（图2g）。

为了在体外探究FasL-DC-Lipo的生物学功能，作者利用中性粒细胞和活化T细胞来检测其疗效（图2h）。作者首先检测了活化CD4 + 和CD8 + T细胞上Fas的表达（图2i-j），结果显示Fas表达显著上调，这与体外IBD病变的结果一致。接着，作者检测了FasL-DC-Lipo引起的细胞凋亡效应，结果显示，FasL-DC和FasL-DC-Lipo诱导了活化T细胞的显著凋亡，如果预先用抗Fas抗体处理T细胞，凋亡可以被逆转（图2k）。最后，作者研究了FasL-DC-Lipo对中性粒细胞的影响，当用载有RvE-1的悬浮液处理时，中性粒细胞的迁移减少，而凋亡中性粒细胞的比例增加（图2l-m）。以上结果表明FasL-DC-Lipo在体外可诱导CD8 + T细胞和中性粒细胞凋亡。

图2. FasL-DC-Lipo的制备与表征

3.0FasL-DC-Lipo能减轻小鼠IBD模型中的炎症反应

为研究FasL-DC-Lipo在体内是否能够发挥作用，作者构建了IBD小鼠模型（葡聚糖硫酸钠DSS诱导），腹腔注射FasL-DC-Lipo，注射24h后检测到小鼠的回肠和结肠中的荧光信号，表明FasL-DC-Lipo能够有效地在肠道中聚集（图3a）。FasL-DC-Lipo组回肠和结肠的荧光强度分别是脂质体组的7.1倍和6.2倍（图3b），回肠固有层和派尔集合淋巴结（PPs）中检测到了明显的荧光信号（图3c），且FasL-DC-Lipo组的RvE-1含量较高（图3d）。

为了探究经腹腔注射的FasL-DC-Lipo到达肠道的迁移路径，作者在特定时间点采集了肠系膜和腹膜组织。定量荧光成像显示，肠系膜中的信号强度最为显著，随着时间的推移信号强度逐渐减弱，而腹膜中的信号则始终处于较低水平（图3e-f），这表明FasL-DC-Lipo可能与肠系膜血管相互作用，从而促进向肠道的迁移。在肠固有层中，FasL-DC-Lipo分布在血管附近，部分与血管壁共定位，而在淋巴管的分布则非常少（图3g）。这些结果表面FasL-DC-Lipo会附着在肠系膜血管上，侵入血管，随后扩散至肠黏膜下层、淋巴结以及浆膜下层。

随后，作者研究了FasL-DC-Lipo针对IBD的免疫学作用机制。由于DSS引发的急性结肠炎具有肠道溃疡和中性粒细胞浸润的特征，于是作者分别在第2、4和6天给小鼠注射FasL-DC-Lipo，第8天分离并检查结肠固有层免疫细胞（ILCs）检测其浸润情况，以判断FasL-DC-Lipo治疗是否会影响ILCs（图3h）。结果显示，用FasL-DC-Lipo处理后，结肠中的T细胞和中性粒细胞浸润显著减少（图3i），中性粒细胞数量与健康小鼠相当（图3j）。与之一致的，FasL-DC-Lipo减少了促炎性M1巨噬细胞的数量，同时增加了抗炎性M2巨噬细胞的数量（图3k），结肠中的CD4 + T细胞和调节性T细胞（Tregs）数量显著增加（图3l）。已有研究报道，Tregs会分泌IL-10并有助于维持肠道稳态。此外，与健康小鼠相比，IBD小鼠CD8 + T细胞数量增加，而FasL-DC-Lipo处理后，CD8 + T细胞的数量显著减少，与健康小鼠相比并无显著差异（图3m）。作者还检测了典型的促炎性（TNF-α、IL-1β、IL-6）和抑制性（IL-10）细胞因子的含量，发现FasL-DC-Lipo处理的小鼠中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平降低，而IL-10的水平升高（图3n-q）。以上结果表明，在由DSS引发的IBD模型中，FasL-DC-Lipo可通过调节ILCs的免疫反应来减轻结肠炎症。

图3. DSS诱导的IBD小鼠中的抗炎免疫反应

4. FasL-DC-Lipo能缓解小鼠的IBD

为进一步评估FasL-DC-Lipo在由DSS诱导的IBD小鼠模型中的治疗效果，作者构建了UC的小鼠模型，然后对其进行三次治疗（图4a），结果显示FasL-DC-Lipo对DSS诱导的IBD有显著的保护作用。FasL-DC-Lipo组与DSS处理组的小鼠的体重存在显著差异，而FasL-DC-Lipo组与健康小鼠之间则未检测到显著差异（图4b）。接受FasL-DC-Lipo治疗的小鼠的疾病活动指数（DAI）评分明显低于其他UC小鼠（图4c）。DSS诱导的IBD会导致小鼠结肠长度缩短，脾脏重量增加，然而FasL-DC-Lipo处理组的结肠长度和脾脏重量均无显著变化（图4d-f）。苏木精-伊红（H&E）染色结果显示，FasL-DC-Lipo治疗能够保护结肠上皮免受病理损伤，使小鼠存活率显著提高至90%（图4g-h）。此外，IBD导致髓过氧化物酶（MPO）活性升高，而FasL-DC-Lipo处理组的MPO水平大幅下降（图4i），这表明FasL-DC-Lipo能够减轻肠道的氧化应激。

为了进一步扩大FasL-DC-Lipo在IBD治疗中的应用范围，作者对2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的克罗恩病模型进行了疗效研究（图4j）。作者分别在第2天、第4天和第6天对TNBS诱导的IBD小鼠使用不同的制剂进行治疗，对体重变化、DAI评分、结肠长度、脾脏重量和结肠损伤的比较表明，FasL-DC-Lipo能够在体内显著减轻TNBS诱导的IBD的症状（图4k-o）。

图4. FasL-DC-Lipo对IBD小鼠的治疗效果

5. FasL-DC-Lipo在兔子模型中抑制IBD

在大型动物模型中，兔子的微生物群落与人类相似，微生物生命周期也与人类相近，因此作者建立了兔子IBD模型（DSS诱导），造模三天后，在兔子模型中观察到IBD的症状，包括体重减轻、DAI评分升高以及食物和水摄入量减少。造模第2、4、6天腹腔注射FasL-DC-Lipo，结果显示经FasL-DC-Lipo治疗后兔子的体重减轻情况得到了显著改善（图5a-b），并且DAI评分在前5天内有所上升，但从第6天开始又有所下降（图5c）。此外，IBD组的进食和饮水量急剧减少，而FasL-DC-Lipo处理对其影响甚微（图5d-e）。HE染色显示，FasL-DC-Lipo保护了肠道免受炎症引起的损伤（图5f）。在兔子IBD模型中，小肠和结肠等肠道组织病变严重，与健康组相比，IBD兔子结肠中的IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，而FasL-DC-Lipo组中的IL-10水平升高（图5g-k）。这些结果证实FasL-DC-Lipo能够在兔子IBD模型中减轻肠道炎症。

图5. FasL-DC-Lipo在DSS诱导的IBD兔子模型中的疗效

利用人类PBMC和BMDC来源的树突状细胞制备FasL-DC-Lipo

最后，作者对PBMC和BMDC来源的细胞-药物结合物进行了测试（图6a）。收集人类外周血，分离单核细胞，培养以生成成熟树突状细胞（moDCs），制备FasL-DC-Lipo，并通过荧光染色证实了moDC来源的FasL-DC-Lipo的成功制备（图6b-c）。同样，大约50%的BMDCs也与脂质体结合并表达FasL（图6d-e）。这些数据表明，人源moDCs和BMDC是制备FasL-DC-Lipo的可行来源。

为了探究这种转化潜力在人类身上的应用效果，作者从IBD患者身上采集了结肠炎组织，并获得了单细胞悬浮液，与FasL-DC-Lipo细胞进行共培养（图6f）。结果显示，利用moDC和BMDC制备的FasL-DC-Lipo能显著诱导T细胞凋亡（图6g-h）。FasL-DC-Lipo处理后，来自结肠炎组织的CD8 + T细胞和中性粒细胞显著减少（图6i-j）。与对照组相比，FasL-DC-Lipo组中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平降低，而IL-10的水平升高（图6k-n）。这些结果表明，moDCs和BMDCs均适合用于制备FasL-DC-Lipo，且能够减轻炎症反应。

图6. 基于人类PBMCs和BMDCs的FasL-DC-Lipo的制备及表征

总结

综上，作者开发了一种基于DC的生物免疫调节剂，用于缓解IBD患者的肠道炎症。FasL的基因工程改造以及负载RvE-1的脂质体的化学工程改造易于实施，并对肠道T细胞和中性粒细胞表现出强大的免疫调节作用。研究结果提供了一种有效的针对肠道的免疫调节方案，或可用于IBD的治疗。