体外细胞水平 CRISPR/Cas9 基因编辑服务

CRISPR/Cas9 系统由 Cas9 核酸酶和 sgRNA 两部分组成。sgRNA 与靶序列互补配对，将 Cas9 引导至指定位点；Cas9 在 PAM 上游约 3 bp 处切割 DNA，形成双链断裂（DSB）。细胞随后启动修复，其中非同源末端连接（NHEJ）常产生少量碱基插入或缺失。若突变发生在编码区，可引起移码突变和基因功能丧失。

递送方式可按实验目标选择：

三条路。质粒靠转染，慢病毒和腺病毒靠感染。

sgRNA 引导 Cas9 在靶位点产生双链断裂，细胞修复时引入插入或缺失突变，导致基因移码与功能丧失。该策略技术成熟，应用广泛。

可同时转染针对多个基因的 gRNA，或先构建 Cas9 稳转细胞株，再逐个导入 gRNA。靶基因数量越多，难度越高，筛选策略应在方案阶段确定。

dCas9 融合转录激活或抑制元件，不改变 DNA 序列，仅调控转录水平。适用于必需基因研究或需要可逆调控的实验。

lncRNA、miRNA、circRNA 的编辑策略与编码基因不同，需结合转录本结构和剪接位点单独评估。

sgRNA 表达载体：U6 等 Pol III 启动子驱动。每个靶基因建议设计 3–4 条 sgRNA 并联筛选，以降低单条效率不足导致的返工。

Cas9 表达质粒：常规 SpCas9，或带筛选标记、荧光标签的融合形式，如 pSpCas9(BB)-2A-EGFP/PURO，同时携带 EGFP 和嘌呤霉素抗性，便于转染后药筛或流式富集。

Cas9-sgRNA质粒：sgRNA 和 Cas9 在同一个载体上，一次转染完成导入。

Cas9n 双切口与 dCas9 系统：前者降脱靶，后者做表达调控。

启动子：sgRNA 常用 U6 等 Pol III 启动子；Cas9 常用 CBh、EFS、EF1a 等 Pol II 启动子。启动子强度需与表达量、脱靶风险平衡，并非越高越好。

标记：抗性基因（Puro/Bsd/Neo）用于药筛富集；荧光蛋白（EGFP/mCherry）用于评估转染效率和分选。转染效率较低的细胞，建议选择带标记载体。

单载体还是双载体：Cas9-sgRNA 单载体操作简便，适合转染效率高的细胞；双载体在后续病毒包装中更灵活。

质粒依赖转染，难转染细胞效率有限，且表达呈瞬时衰减。这两类建议选择慢病毒 或 腺病毒。

慢病毒通过感染进入细胞，不依赖转染，可覆盖原代细胞、悬浮细胞、神经元、免疫细胞等。构建敲除细胞株通常采用该方式。

sgRNA 慢病毒：感染已稳定表达 Cas9 的细胞系。片段较小，滴度较高，适合文库筛选和多靶点并行。

Cas9 慢病毒：先建立 Cas9 稳转株，再导入 sgRNA，适合需要反复更换靶点的项目。

Cas9-sgRNA 慢病毒：一次感染完成系统导入，操作最省事。

可诱导、条件性表达系统：用于控制编辑发生时间，减少持续表达带来的脱靶累积。

sgRNA 文库慢病毒：按项目规模包装，重点关注滴度和文库覆盖度。

基因组保持干净：腺病毒以游离体形式存在于细胞核内，不整合入基因组。后续需测序或不愿引入插入突变的实验可优先考虑。

原代细胞也能打进去：通常高于质粒转染，且载体容量大于 AAV，可容纳 SpCas9 全长。

表达强但衰减快：编辑窗口主要集中在前一阶段，随后表达下降。需长期稳定表达时建议选择慢病毒。

腺病毒可用于体外细胞感染，也可通过尾静脉等途径用于动物在体编辑。但在体应用对病毒纯度和内毒素要求显著高于体外，方案阶段需明确用途。若需长期、组织特异性在体编辑，AAV-SaCas9 更合适。免疫原性和通用技术参数见 腺病毒包装服务。

注：具体质控标准以项目合同和 COA 为准。